众所周知，大多数病毒感染了微生物，植物和动物。它们会引起熟悉的传染病（例如流感和疣），甚至引起一些严重的疾病，例如天花，埃博拉病毒和艾滋病毒/艾滋病。由于已经种植了不到1％的微生物宿主，因此识别和衡量环境中病毒的社区动态非常重要。与细菌和真菌不同，没有进化保守的基因，因此使用类似于类似的方法来监测病毒多样性是不可行的16s/18s/其扩增子测序欧宝体育官网网址。病毒宏基因组学可以提供有关病毒群落组成和结构的见解。
病毒宏基因组学的工作流程包括样品收集，类似病毒的颗粒纯化，核酸提取，文库制备和宏基因组学测序。欧宝体育官网网址类似于宏基因组学工作流程，但它们在某些步骤上有所不同。首先，要富集病毒体至关重要。其次，对于RNA病毒，需要将病毒RNA转换为cDNA。
图1.用于病毒的宏基因组分析的工作流程图（Cholleti等。2018）。
在自由和细胞DNA的存在下分离代表性的社区DNA很复杂。病毒基因组的平均值（〜50 kb）比平均微生物基因组（〜2.5 MB）小50倍。因此，如果未去除游离DNA，病毒DNA信号将被细胞污染淹没。在这里，我们以污水和临床样本为例，以介绍如何富集病毒体。
污水样品。最初，将25 mL的甘氨酸缓冲液（0.05 m甘氨酸，3％牛肉提取物，pH 9.6）添加到200毫升的污水中并混合，以脱离与有机材料结合的病毒颗粒。然后将样品以8,000×g离心30分钟。收集上清液并通过0.45μm聚乙烯（PES）膜过滤，以去除原核细胞和真核细胞。通过与PEG 8000（80 g/L）和NaCl（17.5 g/L）在4°C的搅拌（100 rpm）中孵育，从上清液中沉淀病毒，然后在13,000×g下离心90分钟。在1 mL磷酸盐缓冲液盐水（PBS）中洗脱了所得的含病毒的沉淀，并在进一步加工之前存储在-80°C下。
临床样本。在病毒颗粒纯化之前，有必要准备组织匀浆。为了均质化，将一小块组织（约0.5-1 cm3）放在装有1 ml PBS缓冲液和20-30次无菌陶瓷珠的高压棒螺钉管中。通过使用FastPREP-24仪器以15 s的最大速度摇动4次，从而破坏组织。此过程的持续时间约为0.5 h。科尔等。（2015）描述了有关临床标本中病毒纯化的更多信息（图2）。
图2.基于临床的通用病毒富集病毒宏基因组学方案的示意图描述（KOHL等。2015）。
遵循病毒颗粒纯化后，将所有病毒浓缩物在37°C下用DNase I和RNase处理15分钟以去除细胞外核酸，然后将酶在70°C下停用5分钟。
在传统方法中，一旦病毒体分离，就会提取并克隆病毒元基因组。克隆代表性的病毒宏基因组仍然具有挑战性，这是由于低核酸浓度（〜10-17g DNA每个病毒体），修饰的DNA和致死病毒基因的存在，例如溶菌酶和霍林斯。要解决这个问题，爱德华兹等。（2005年）开发了解决方案。首先，有必要获得足够的病毒体进行克隆。接下来，接头放大的shot弹枪库（LASL）技术使得通过PCR扩增步骤克隆少量DNA并将修饰的DNA转换为未修饰的DNA。然后，剪切步骤通过将DNA碎片分成小片段（约2 kb）来破坏致命的病毒基因。因此，可以制作代表性的元基因组学库。
如今，有许多出色的套件用于制备病毒核酸，例如Qia（Qiagen），NUC（Macherey-Nagel），Min（Biomerieux）和POW（MO BIIO）。对于RNA病毒，需要将RNA转换为cDNA。或者，RNA病毒基因组可以用Trizol-LS纯化®试剂和DNA病毒基因组可以通过从纯化的病毒颗粒中提取苯酚纯化。应使用Ribogreen定量纯化的病毒DNA/RNA的浓度®或picogreen®技术。如果核酸的量不足以进一步分析，则可以使用整个基因组/转录组扩增试剂盒来实现DNA/cDNA的扩增。
NGS库的准备使用依赖选择的测序平台的适当套件进行。欧宝体育官网网址病毒宏基因组测序的常见平台包括Illumina Miseq和Hiseq，Pacbio r欧宝体育官网网址s II，等。病毒宏基因组学的基本生物信息学管道包括质量检查（识别和去除序列重复和质量较差的基础），宿主基因组映射（使用几种简短的读取工具，例如SOAP2，BWA和BOWTIE2），以及对病毒序列分类分类的分类。
图3.病毒宏基因组学的基本信息学分析（Cholleti等。2018）。
参考：
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