小RNA测序的挑战和工作流程欧宝体育官网网址

什么是小RNA测序?欧宝体育官网网址

小核糖核酸测序欧宝体育官网网址代表了一种越来越流行的方法来解决miRNAs和其他小非编码RNA (sncRNAs)的生物学问题，如piwi相互作用RNA (piRNAs)，小干扰RNA (sirna)，转录起始RNA (tirna)。MiRNAs、piRNAs和siRNA是最受关注的三种sncRNAs，由于它们在基因表达的翻译后调控中起着至关重要的作用，因此通过测序得到了广泛的研究。欧宝体育官网网址小RNA测序已经成为欧宝体育官网网址小RNA发现和小RNA图谱的良好标准，因为它们能够以高通量和高灵敏度对小RNA的全部补体进行测序。与微阵列和qPCR相比，小RNA测序不需要序列的先验知识。欧宝体育官网网址除了获得完整的miRNA和小RNA物种，小RNA测序还有助于理解转录后调控如何影响表型和识别新的生物标志物。欧宝体育官网网址它已被广泛应用于癌症和复杂疾病的研究。

• 挑战：小RNA连接偏倚

研究人员逐渐发现，含有小rna差异表达的测序数据有时与微阵列、qPCR和Northe欧宝体育官网网址rn blot结果不一致。这主要归因于在小RNA库构建过程中引入的特定适配器序列的RNA连接酶依赖偏倚。研究表明，将连接连接处附近的适配器序列随机化可以减少连接偏倚并优化测序结果。欧宝体育官网网址Bioo Scientific的NEXTflex Small RNA-seq试剂盒是目前市面上唯一可用于减少结扎相关偏倚的试剂盒。这个套件利用适配器与4nt随机端提供了一个更均匀的覆盖个体小RNA物种。巴兰-盖尔的作品等，（2015）表明，NEXTflex协议是小RNA测序的偏见最小的试剂盒。欧宝体育官网网址

表1.用于小RNA文库构建的商用试剂盒。

小RNA测序的工作流程欧宝体育官网网址

小RNA测序的工作流程一般包括总RNA分离、小RNA欧宝体育官网网址文库构建、深度测序和生物信息学分析。

• 小RNA文库构建

小RNA上的5'磷酸和3'羟基允许连接酶选择性地靶向和捕获这些小RNA物种。对于小RNA测序，文库构建通常首先使用T4 RNA连接酶2的截短版本将前腺苷酸化DNA适配器连接到sRNA的3'端，然后使用T4 RNA连接酶1将RNA适配器连接到其5'端。连接后，产物可以很容易地反转录成cDN欧宝体育官网网址A，并在高通量测序之前通过PCR扩增。有许多商用试剂盒可直接从总RNA样本生成小RNA文库（表1）。产品适用于Illumina测序。图1概述了小RNA文库构建的一般原则，但不同的试剂盒可能有一些不同的协议。凝胶纯化过程致力于质量控制和尺寸选择。根据您的研究兴趣，通过基于珠粒的大小选择或PAGE纯化进行深度测序来恢复适当大小的序列。18-40bp插入cDNA文库是一种典型的选择，包括miRNA、siRNA和piRNA。请注意，测序miRNA和mRNA需要两个独立的文库协议，即使总RNA样本相同。在对小RNA文库进行质量控制后，进行高通量测序。Illumina平台是最流行的小RNA测序工具，如MiSeq和HiSeq。

图1。小RNA文库构建的原则。

• 生物信息学分析

小RNA测序可用于小欧宝体育官网网址RNA聚类、新的小RNA发现、小RNA靶点预测、小RNA差异表达、进化分析和功能分析。但在此之前，需要对原始测序数据进行预处理和标准化。数据预处理包括移除适配器和条形码、大小选择、移除复杂读取以及生成唯一读取。规范化是使表达式级别在库之间具有可比性的过程。Rfam和miRBase是两种常用的小RNA分析数据库。Rfam是一个开放存取数据库，提供有关tRNA、rRNA和SnRNA等的信息。miRBase包含所有已知跨物种miRNA的序列和注释。

图2。小RNA测序数据的生物信息学分析流程（Buschman）欧宝体育官网网址等．2016)。

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引用:

1. Baran Gale J、Kurtz C L、鄂尔多斯M R、，等．定位小RNA库测序制备中的偏倚:一种新的协议可以恢复现有方法逃避捕获的microrna。欧宝体育官网网址中国生物医学工程学报，2015,30(6):655 - 662。
2. 巴斯曼D，哈伯伯格A，基什内尔B，等．在液体活检时代，如何标准化小RNA-Seq工作流程，以获得可靠的生物标志物签名。核酸的研究, 2016, 44(13): 5995-6018.
3. Fuchs R T，孙泽，庄芳，等．基于连接的小RNA测序文库构建的偏倚由适配器和RNA结构决定。欧宝体育官网网址《公共科学图书馆•综合》, 2015,10 (5): e0126049。