ChIP-seq的优点和工作流程

介绍ChIP-Seq

ChIP-欧宝体育官网网址sequencing(也称为ChIP-seq)，它结合了染色质免疫沉淀(ChIP)和DNA测序，是一种强大的技术，用于DNA结合蛋白、组蛋白修饰或核小体的全基因组分析。欧宝体育官网网址ChIP是一种免疫沉淀(IP)实验方法，用于分离与转录因子等蛋白质直接物理作用的特定DNA位点。在ChIP中，特异性抗体被用来富集与特定蛋白质或核小体结合的DNA片段。

ChIP-seq是NGS(下一代测序)的早期应用之一，第一欧宝官网app苹果下载次使用ChIP-seq大规模分析全基因组组蛋白甲基化欧宝体育官网网址的研究发表于2007年(Barski等, 2007)。本研究在欧宝体育官网网址Solexa 1G基因组分析仪平台上进行测序。同年，约翰逊等．(2007)使用ChIP-seq生成转录因子结合位点的全基因组图谱。罗伯逊等．(2007)开发了ChIP-seq，用于识别转录因子结合的哺乳动物DNA序列在活的有机体内．这两篇论文也证明了ChIP-seq增加了敏感性和特异性。由于NGS技术的快速发展和测序成本的降低，ChIP-seq已经成为表征表观基因组和基因调控研究不可或缺的工具(Park, 2009)。欧宝体育官网网址

ChIP-chip和ChIP-seq的比较

ChIP- ChIP、ChIP偶联微阵列和ChIP-seq是两种鉴定全基因组dna -蛋白质结合相互作用的标准技术。利用测序技术，ChIP-seq比ChIP欧宝体育官网网址-chip有很多优势，如表1所述(Park, 2009;Schones和Zhao, 2008)。

表1。ChIP-chip和ChIP-seq的比较。

工作流的ChIP-seq

ChIP-seq用于分析转录因子、DNA结合酶或其他DNA相关蛋白(非组蛋白ChIP)的特定DNA结合位点和修饰核小体(组蛋白ChIP)对应的DNA位点的工作流程如图1所示(Park, 2009)。根据ChIP协议，染色质片段化并交联蛋白质或修饰的核小体，使用特定于蛋白质或组蛋白修饰的抗体免疫沉淀。经过DNA纯化和文库构建后，DNA片段可以在任何测序平台上同时测序，如Illumina Solexa Genome Analyzer、Roche 454和Applied Biosystems (ABI) SOLiD平台欧宝体育官网网址以及Helicos的HeliScope，如图1所示。随着NGS技术的巨大进步，Illumina平台，如Hiseq，已经成为应用最广泛的测序平台。欧宝体育官网网址

图1所示。ChIP-seq实验概述(Park, 2009)。

ChIP-seq实验设计

DNA元素百科全书(ENCODE)和模式生物ENCODE (modENCODE)联盟基于数百个ChIP-seq实验(Landt)的经验，制定了一套ChIP-seq实验的工作标准和指南等, 2012)。为了获得高质量的ChIP-seq数据，ChIP-seq实验设计需要考虑几个技术方面，包括抗体、细胞数量、对照、复制、染色质片段、文库构建和测序(Kidder)欧宝体育官网网址等, 2011)。

• 抗体
  • ChIP所用抗体的质量是影响ChIP-seq数据质量的最重要因素之一。
  • 一种敏感而特异的抗体将提供高水平的富集。抗体效率有限是ChIP-seq实验失败的主要原因。
  • 抗体验证和鉴定应在ChIP开始前完成。
• 手机号
  • 由于信噪比(SNR)与细胞数直接相关，使用正确的细胞数有助于减少背景噪声。
  • 在确定细胞数量时，应考虑待调查的蛋白质或组蛋白修饰的丰度和抗体的质量。
• 控制
  • ChIP-seq实验设计的一个重要部分是确定使用哪些控件。ChIP-seq峰应该与匹配控制中的相同区域进行比较。
  • 有几种不同的控制类型，但对于哪一种是最合适的没有共识:
    • 输入DNA。
    • 模拟IP:不含抗体的IP获取的DNA。
    • 非特异性IP:使用抗体对抗未知的DNA结合蛋白。
• 复制
  • 高质量的ChIP-seq数据集是社区的宝贵资源。许多因素，包括细胞培养条件、芯片和库的建设，可能导致数据集之间的变异性。
  • 为了保证数据的可靠性，需要进行生物复制实验。
• 染色质分散
  • 在ChIP之前，染色质必须被分割成可控制的大小。
  • 用于DNA结合蛋白的ChIP-seq使用内切酶消化或超声来片段DNA。
  • 用于组蛋白修饰的ChIP-seq使用微球菌核酸酶(MNase)酶切来片段DNA。
• 图书馆建设与排序欧宝体育官网网址
  • 可以通过特定于测序平台的标准协议从ChIP DNA构建文库。欧宝体育官网网址
  • 建库和测序的过程，包括大小选择、凝胶纯化、PCR、单端或对端测序策略、测欧宝体育官网网址序深度等，都会影响ChIP-seq数据质量。

考虑到上述技术方面，ChIP-seq实验设计将获得高质量的数据如图2 (Kidder等, 2011)。首先，在ChIP之前需要确定合适的抗体特异性对照。在分离出理想数目的细胞后，染色质被超声或酶切成理想的大小范围。接下来，ChIP使用高质量的抗体。纯化芯片富集的DNA后，构建一个文库，以便在NGS平台上进行测序。欧宝体育官网网址

图2。ChIP-seq实验设计(Kidder等, 2011)。

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芯片seq分析的管道和工具

引用:

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