CRISPR测欧宝体育官网网址序:简介，工作流程和应用欧宝官网app苹果下载

CRISPR-CAS9系统

CRISPR-Cas9基因靶向系统由两部分组成:自定义向导RNA (sgRNA包含有针对性的crRNA序列和tracrRNA)和非特异性CRISPR-associated核酸内切酶(Cas9),是一种新的基因工程工具,允许科学家修改的部分基因组通过删除,添加或修改的部分有机体的DNA序列。它是目前最简单、灵活、准确和有效的基因操作方法，在医学和作物种子改良方面有许多应用。欧宝官网app苹果下载CRISPR-Cas9还通过允许高通量基因组编辑，彻底改变了靶向突变的产生。

CRISPR测序介绍欧宝体育官网网址

在CRISPR实验过程中，验证编辑尤其重要。因为可以发生脱靶突变，而不是靶基因的编辑，下一代测序(NGS)是一种简单和高通量的技术，以验证首选突变。欧宝体育官网网址对于学术界、诊所和工业界来说，CRISPR扩增子测序已经成为一种标准化的验证方法。欧宝体育官网网址高通量CRISPR筛选的思路集中在靶向扩增子测序上，这是通过在聚焦区域两侧放置引物的PCR实验完成的。欧宝体育官网网址检测突变最精细的技术是靶向扩增子测序，其检测频率低至0.01%。欧宝体育官网网址

图1.针对性测序的基于CRISPR的浓缩策略。欧宝体育官网网址（Schultzhaus，2020）

CRISPR测欧宝体育官网网址序可以提供关于突变的性质和各种的直接和综合数据，例如敲除/敲蛋白等位基因的确认，SGRNA切割效率评估，纯合和杂合鉴定，突变频率计算，等等。

CRISPR测欧宝体育官网网址序工作流程

DNA分离、PCR实验、深度测序和数据分析都是CRISPR突变测序工作的一欧宝体育官网网址部分。研究者可以利用CRISPR突变测序来验证引导文库，评估CRISPR/Ca欧宝体育官网网址s9靶标和突变效率，找到最有前景的靶点。

第1步:设计-选择一种Cas酶并创建一个引导RNA。

第2步：提供 - 建议将CAS酶和引导RNA组合形成核糖核蛋白，以递送CAS酶并引导RNA至细胞（RNP）。然后可以使用电穿孔或脂质素来将RNP递送至细胞。为了提高转染效率，可以用于Cas9和Cas12a的单独的电穿孔增强剂。

第3步修复-含有Cas9或cas12a的RNPs切断基因组DNA，导致双链断裂(DSB)。非同源端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)是细胞内的自然过程。NHEJ通路可用于敲除以研究基因功能。HDR不仅需要RNP来创建DSB，还需要一个指导修复的蓝图，并且可以用来引入特定的突变。

步骤4：分析 - 根据您的研究需求，您可以使用各种方法来检测突变。可用于基于凝胶的方法来以非特异性方式确定在基因组序列中的过渡的存在。强烈建议下一代测序（NGS），以欧宝体育官网网址建立目标编辑和调查偏离目标效果的成功。

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CRISPR-CAS9技术改变了修饰DNA的能力，并调节感兴趣基因的表达水平，提供有效的工具，以加速各种生物的准确工程。此外，CRISPR-CAS系统可用于创造基于其DNA序列的细菌病原体的“精确”抗微生物剂。通过选择性靶向与抗生素抗性相关的基因，生物膜形成和毒力，这种潜力将允许耐药微生物被杀死。

引用:

1. 舒德豪斯Z，王Z，维客D.基于Crispr的富集浓缩策略，用于有针对性测序。欧宝体育官网网址生物技术进步。2020年11月28:107672。
2. de la Fuente-Núñez C, Lu TK。CRISPR-Cas9技术在基因组工程中的应用、欧宝官网app苹果下载序列特异性抗菌剂的开发及未来展望综合生物学。2017年2月1;9(2)。
3. Selle K, Barrangou R.基于CRISPR的技术和食品科学的未来。中国食品科学杂志。2015年11月,80(11)。
4. Makarova ks，狼yi，Alkhnbashi Os，等。CRISPR-Cas系统的最新进化分类。自然评论微生物学。2015年11月,13(11)。