全外显子组测序的原理和工作流程欧宝体育在线欧宝体育官网网址

随着生物实验技术特别是基因测序技术的发展，实验室和临床研究者都认识到基因组测序是分析疾病病因、病理生理、治疗和预后的最佳方法。研究进一步表明，只有3欧宝体育官网网址000万个碱基对的基因包含人类蛋白质的基本信息。

外显子组通常被定义为包含蛋白质编码基因的所有外显子，以及microRNA或lncRNA等非蛋白编码元件的序列。对外显子组的研究有助于找出哪些基因座对特定疾病负有责任。当研究人员计划探索人类基因组的外显子信息时，考虑到人类基因组的总长度超过30亿个碱基对，整个基因组测序的成本将相当惊人。欧宝体育官网网址研究罕见的孟德尔病，外显子组测序是一种更有效的识别遗传变异的方法。欧宝体育官网网址靶富集技术和DNA测序技术的突破，促进了生物技术的发展欧宝体育官网网址ob 官网 ．

外显子组测序原理欧宝体育官网网址

外显子组测序欧宝体育官网网址包含两个主要过程，即目标富集和测序。目标富集是从DNA样本中选择和捕获外显子组。实现外显子组富集的方法主要有两种。

• 制成的外显子组浓缩使用与高密度微阵列结合的探针捕获外显子组。微阵列是在玻片或硅薄膜上的二维阵列，它含有与目标基因组部分互补的寡核苷酸。当片段DNA样本流过微阵列时，互补配对效应将迫使外显子组在微阵列上结合，基因组的其他部分保持解离，从而导致外显子组与基因组的其他部分分离。
• 在溶质捕获中是基于磁珠的。磁珠是一种含有功能性化学成分的磁性纳米颗粒。在这种情况下，可以结合外显子组的磁珠被使用。然后，基于阵列的方法也是一样的，外显子组被吸引并绑定到磁珠上，而基因组的其他部分仍然是游离的。溶质俘获法的优点是使用磁珠使反应更有效，通过摇动或加热系统。

这两种方法都是从基因组中提取外显子的有效方法。所以我们说两者的敏感性都足够高。然而，问题是特殊性。基因组的某些部分具有相似的外显子序列。基因组的这些部分可能与微阵列或磁珠结合，导致假阳性。

欧宝体育官网网址测序是确定所有脱氧核糖核酸在外显子组中排列的过程，这可能有助于我们了解某些疾病中潜在的病理生理改变。由于成本的降低，全外显子组测序的重要性日益突出。人类基因组的成本大约相当于整个外显子组测序成本的两到三倍。那么，为什么不使用全外显子组测序来运行更多样本，以获得更具统计学意义的结果呢？欧宝体育在线

外显子组测序的一般流程欧宝体育官网网址

以下是外显子组测序的一般工作流程。欧宝体育官网网址下面将讨论工作流中主要流程的说明。

图1。全外显子组测序的工作流程。请注意，不欧宝体育在线同类型的样品欧宝体育官网网址、试剂盒和测序仪器的详细程序各不相同。研究人员应遵循试剂、试剂盒和测序仪器的说明。

•准备DNA样本:DNA片段

几乎所有的DNA实验都是从DNA片段开始的。DNA应该剪成合适的片段，因为通常从组织或细胞中提取的DNA样本的长度太长。这种剪切过程称为DNA片段。有效靶长由您选择的测序仪决定。欧宝体育官网网址为了处理整个外显子组测序，有几种主要的方欧宝体育在线法片段DNA样本。欧宝体育官网网址

• 物理碎片。物理破碎包括声剪切、超声和流体动力剪切。其中，声剪切和超声处理是DNA断裂的主要方法。当DNA样品暴露在超声波下时，由于声空化和流体动力剪切作用，DNA样品被分成几块。
• 酶法。用来将DNA分解成小块的酶包括核酸酶或转座酶。核酸酶会分解核酸之间的磷酸二酯键，导致DNA的分解。具体来说，限制性内切酶将在限制性位点切割DNA。转座酶用于调解转座事件，即某个DNA片段可以在染色体上“移动”的过程。如果我们准备合适的DNA样本和转座酶，它也在DNA断裂中发挥作用。碎片化的DNA与适配器连接，而不是再次插入，导致碎片化。

碎片化后，你们的DNA样本就可以用于目标富集过程了。

•外显子组的分离：target-enrichment方法

外显子组在测序前必须从人类基因组中分离出来，因为前者只占后者的1%。欧宝体育官网网址捕获目标基因组区域的过程称为目标富集。目标富集的基本思想是利用物质之间的物理化学性质差异将任何感兴趣的物质从其他物质中分离出来。有一些常用的靶富集方法。无论您选择哪种试剂盒，捕获的可变性会影响您的外显子组测序，所以要注意您的DNA样本的质量、数量和片段大小。欧宝体育官网网址

表1。用于测序的常用目标富集试剂盒。欧宝体育官网网址

•收获你的产品:清洗和洗脱

外显子组和基因组其他部分分离后，需要多次洗涤。洗涤的过程就像这个词的字面意思一样——洗掉我们不想要的任何东西，以保持我们感兴趣的东西。在这种情况下，我们不需要诸如基因组的其他部分、蛋白质和电解质等物质。通常用蒸馏水来洗脱目标物，但一些特殊的试剂套件可能需要特定的洗脱液。洗脱液是一种从微阵列或磁珠上冲洗外显子组的试剂，它能够打破外显子组和结合物质之间的连接。为了获得更纯的外显子，洗涤和洗脱过程都可以进行多次处理。在某些情况下，还要执行一个目标富集过程以使洗脱更好。请按照您使用的试剂盒说明操作，并根据实际情况调整操作方案。

•测欧宝体育官网网址序技术

由于Sanger测序的时间成本和长度要求，直到下一代测序（NGS）技术发明，测序技术才在生物学和临床研究中做出很大贡欧宝体育官网网址献。NGS技术基于桑格法中染色DDNTP的使用。改进之处在于，NGS允许DNA链同时被结合、扩增和检测，从而导致长度需求和测序效率的急剧增加。为了简化，NGS的原理是将外显子组样品结合在适当的基础上（如Illumina Hiseq的flowcell和Roche-454的磁珠），并通过PCR进行复制-在-原地，以便使信号在每一轮都得到延伸放大。每轮伸长后检测ddNTPs。最后，利用生物信息算法对完整序列进行集成。NGS大大提高了效率，允许更高的通量检测，这就是为什么NGS也被称为高通量测序，并被广泛使用。欧宝体育官网网址

除NGS外，第三代测序技术发展迅速，大大超过了NGS的效率。第三代测序的关键特征欧宝体育官网网址是单分子测序。它缩短了生产的时间和成本全基因组测序欧宝体育官网网址到几分钟。PacificBio和Oxford Nanopore等公司已经证明了他们的方法是有效的，第三代测序技术可能会在外显子组测序领域引发一场革命。欧宝体育官网网址

以下是目前常用的全外显子组测序方法。欧宝体育在线欧宝体育官网网址

表二。目前常用的测序方法。欧宝体育官网网址

*对于第三代测序，通常通过多次测序来提高准确欧宝体育官网网址度。

•数据分析

在进行生物信息学分析和解欧宝体育官网网址释之前，测序的数据往往是混乱的、不可读的，因为大多数测序方法产生的序列都是短片段，需要序列组装才能得出最终结果。有兴趣对变异呼叫和遗传疾病进行WES分析的研究人员可以使用以下管道。

Figure2。典型的变体调用管道。

结论

无论是在学术研究还是临床诊断方面，我们都从外显子组测序中受益良多。欧宝体育官网网址由于外显子组测序，对基因组的理解欧宝体育官网网址被发展到一个新的水平。许多疾病曾经是谜，比如婴儿的神经紊乱，现在可以预测了。此外，许多治疗方法很少的疾病，如癌症，可以通过靶向治疗来治疗。据说第四代测序技术正在开发中。欧宝体育官网网址希望它能推动生物和医学研究的另一场革命。

如果您对我们的基因组学服务感兴趣，请随时与我们的科学家联系。我们非常乐意提供帮助。除了基因组测序欧宝体育官网网址，我们还提供包括ob 体育 ,表观基因组学,微生物基因组学,单细胞测序欧宝体育官网网址,PacBio SMRT测欧宝体育官网网址序．

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