有针对性地区富集的当前技术

什么是有针对性区域测序？欧宝体育官网网址

尽管全基因组测序欧宝体育官网网址涵盖生物体的整个基因组，目标区域测序欧宝体育官网网址确定感兴趣区域中核苷酸的顺序。利用靶向基因组测序，可以以高灵敏和特定的方式检测SN欧宝体育官网网址P，Indels，CNV和大型SV。与全基因组测序相比，靶向基因组测序更加集中，经济，欧宝体育官网网址有效。此外，可以以更低的成本在更大的深度下测序靶区域，这有助于检测稀有变化。欧宝体育在线整体exom欧宝体育官网网址e测序是靶向基因组测序的一个例子，因为它专注于外显子。并使用目标或“热点”面板，我们可以序列感兴趣的基因阵列。这些基因可能与疾病发病有关的突变，或这些基因是临床可操作的感兴趣基因。这已应用于生物和医学研究，以及临床护理。在这里，我们主要讨论目前的目标丰富技术并推荐合格产品。

针对富集的古典技术

靶富集极大地促进了靶向区域测序的发展，使得能够对复杂基因组的负担得起和有效。欧宝体育官网网址有针对性的浓缩有三种古典策略（图1）。

图1.有针对性的浓缩的策略（erertes等。2011）。1）杂交捕获在微阵列（A）或溶液（B）上。2）MIPS（a）或选择器探针（b）的富集。3）典型PCR（A），多重PCR测定（B），以及高达20,000个引物对（C）的摩擦微液滴PCR。

• 混合捕获

霰弹枪片段库准备与含有与目标区域互补的DNA片段的文库杂交。这可以在微阵列或溶液中进行。Mamanova.等。（2010）发现，对于小型目标尺寸（约3.5 MB），溶液捕获产生的目标区域的覆盖率优于基于阵列的方法，并且对于整个极端富集，这两种方法都表现等效。我们建议寻求（Agilent Technologies），Nextera（Illumina），Truseq（Illumina）和SEQCAP EZ（Roche Nimblegen），用于溶液基于杂交的靶向靶向富集。

• 选择性圆形化

分子反转探针（MIPS）由靶特异性序列侧翼的常见序列组成。在对感兴趣区域的杂交之后，将MIP进行间隙填充反应并结扎以产生闭合圆圈。MIPS可以与机械剪切的DNA杂交，而选择器探针使用限制酶鸡尾酒来消化DNA，并且探针适合于限制图案。MIPS和选择器由常见的中央连接器组成，可以将NGS的测序引物包含在该接头中。欧宝体育官网网址因此，不需要NGS图书馆建设。我们推荐哈普克索（安捷伦技术）以获得基于选择性的循环化的目标富集。

• PCR扩增

通过在平行，多重PCR和Microdroplet PCR中进行多个远程PCR，通过进行多个远程PCR来丰富感兴趣的区域。远程PCR有许多可用的产品，包括Sequalprep（Thermo Fisher Scientific）和SEQTarget（QIAGEN），基于高多路复用PCR的离子扩增，以及Raindance的Microdroplet技术。

古典目标富集技术的比较

这四项策略有自己的优点和缺点。例如，PCR的特异性超过了混合捕获的特异性，但其均匀性与MIPS或混合捕获不匹配。有关协议的更新，您可以访问本网站：ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pulldown/。

表1.目标富集方法的比较。改编自Deppich等。（2016）。

高级方法：特定区域的提取（RSE）

传统方法在扩增之前严重依赖DNA的碎片化，其产生相对短的序列（小于1KB）。这是表征复杂基因组基因座的限制因素，因为它们不能提供足够大的碎片来跨越混杂序列元素。幸运的是，Deprapich提出的浓缩方法 - 特定的提取（RSE）等。（2016），通过捕获长DNA片段（约20kb）来解决这种未满足的需求。

RSE原理在图2中概述。简要概述了基因组DNA以与捕获引物杂交。然后用掺入的生物素化的-DNTPS酶促延伸结合的引物。通过链霉蛋白涂覆的磁性颗粒向下拉出靶向DNA段。通过全基因组扩增可以扩增捕获的DNA，随后通过下一代测序加工。欧宝体育官网网址

图2. RSE原则。

评估目标富集实验的指标

在富集实验中需要考虑有几种指标。要处理此问题，已经开发了一种通用的目标浓缩序列描述符（TESD）指标，使得能够评估目标富集结果。欧宝体育官网网址TESD使用以下参数：

1. 兴趣区域，ROI
2. 读取区域的平均读取深度，D_ROI.
3. 特异性，S
4. 富集因子，EF
5. 均匀，E
6. 输入DNA要求的重量，W
7. 足够覆盖X，F的读取深度的分数_X

在七个指标中，ROI和W确定输入要求，另外五个是关于富集（S，EF，E）或测序结果的可测量报告（D.欧宝体育官网网址_ROI.， F_X）。

如果您对我们的Genomics服务感兴趣，请访问我们的网站：www.selfdr.com.了解更多信息。我们可以提供完整的包裹基因组学测序欧宝体育官网网址， 包含全基因组测序欧宝体育官网网址那ob 官网 那目标区域测序欧宝体育官网网址那线粒体DNA（MTDNA）测序欧宝体育官网网址， 和完全质粒DNA测序欧宝体育官网网址。

参考：

1. Dappich J，Ferriola D，Mackiewicz K，等。下一代目标捕获技术 - 大型DNA片段富集和测序决定了高复杂性的区域基因组变异。欧宝体育官网网址BMC基因组学，2016,17（1）：486。
2. Mamanova L，Coffey A J，Scott C E，等。下一代测序的富集策略。欧宝体育官网网址自然方法，2010,7（2）：111。
3. erstes f，elsharawy a，sauer s，等。针对下一代测序的基因组DNA区域的富集。欧宝体育官网网址功能基因组学的简报，2011,10（6）：374-386。
4. McGinn S，Bauer D，Brefort T，等。DNA分析的新技术 - readna项目综述。新生物技术，2016,33（3）：311-330。
5. 珠子，L. Y.，Luthra，R.，Kanagal-Shamanna，R.，等等。临床下一代测序的进展：靶向富集和测序技术。欧宝体育官网网址分子诊断专家综述，2016,16（3），357-372。DOI：10.1586 / 14737159.2016.1133298