全基因组测序的方法欧宝体育官网网址

全基因组测序概述欧宝体育官网网址

每个个体生物的基因组包含其整个遗传信息。全基因组测序欧宝体育官网网址技术可以全面和准确地分析整个基因组，从而打破其中所含的信息并揭示基因组的复杂性和多样性。全基因组测序技术的出现是所有生命科学领域的革命性进步。欧宝体育官网网址全基因组测序可以检测变体，欧宝体育官网网址包括单核苷酸变体，插入/缺失，拷贝数变化和大规模结构变体。全基因组测序可以分类为欧宝体育官网网址德诺维并根据是否存欧宝体育官网网址在参考基因组而重新排序。如果有参考基因组，基因组组装将变得更加简单快捷。

1.对大型基因组进行两种经典方法欧宝体育官网网址

在80年代初期，Sanger通过使用霰弹枪方法成功完成了λ噬菌体的全基因组测序，并且该方法成功地应用于较大的病毒DNA，细胞器欧宝体育官网网址DNA和细菌基因组DNA的测序。霰弹枪测序是全基欧宝体育官网网址因组测序的经典策略。霰弹枪排序策略为大规模测欧宝体育官网网址序提供了技术保障。该技术首先将完整的目标序列随机中断到小片段中，分别测序，然后通过使用这些小片段的重叠关系将它们拼接成一致的序列。它主要包括两种方法：一个是分层霰弹枪测序（克隆克隆方法），另一个是完全基因组霰弹枪测序。欧宝体育官网网址

•克隆逐克隆测序欧宝体育官网网址

该方法曾经由HGP联盟采用。该方法可以产生高密度图，使基因组组件更容易。它通常包括四个步骤，制备Bac克隆文库，克隆指纹的制备，Bac克隆测序和序列组件。欧宝体育官网网址然而，这种方法是耗时且昂贵的，所以目前很少使用。

图1.克隆逐克隆测序所涉及的步骤。欧宝体育官网网址

•全基因组霰弹枪测序（WGS）欧宝体育官网网址

WG通常涉及六个步骤，分离基因组DNA，基因组DNA的随机片段化，使用电泳，文库构建，配对端测序（PE测序）和基因组组件的尺寸选择。欧宝体育官网网址两种不同尺寸的DNA片段包括较长的插入物（2-2.5kb）和短插入件（0.5-1.2 kB）选自琼脂糖凝胶。虽然在噬菌体或Socmid载体中克隆了长插入物，但是在质粒载体中克隆短插入物。短插入克隆库用于从两端进行排序。欧宝体育官网网址由于测序了大量克隆，因此每个基因组将被覆盖超过10次。长插入克隆可用于提高基因组组件的效率。

图2.整个基因组霰弹枪测序所涉及的步骤。欧宝体育官网网址

优点：

• 不需要基因组图。
• 耗时少消耗
• 救球

缺点：

• 由于丰富的重复序列，真核基因组的基因组组件难以
• 使用该方法的基欧宝体育官网网址因组测序不准确。

2. NGS加速WGS

与基于克隆的库方法不同，下一代测序平台利用了一种显着简化的图书馆构建方法，其简化和加速了整个基因组霰弹枪测序。欧宝体育官网网址通常，基因组DNA首先使用超声处理或雾化随机碎片，然后将其连接到特定于平台的双链衔接子，以产生霰弹枪库。随后，可以放大这些库片段原位通过与互补的衔接子杂交和延伸，其与玻璃微流体细胞或小珠子表面共价附着（取决于测序平台）。欧宝体育官网网址所有NGS仪器使用微流体装置来包含霰弹枪库的放大片段，然后是收集正在主动测序的片段的成像步骤。

图3.采用高通量DNA测序方法的主要步骤（GINSBURG＆WILLARD 2008）。欧宝体育官网网址

我们将采用Illumina序列机作为示例，以说明基于高吞吐量排序的WG的工作流程。欧宝体育官网网址

•施加测序库欧宝体育官网网址

首先制备基因组，然后将DNA随机碎片成数百个碱基或短片段，在两端具有特异性适配器。如果测序转录组，图书馆建设有点麻烦。在RNA碎片后，需要反转cDNA，然后加入连接器，或首先将RNA逆转到cDNA，然后片段并加入接头。片段（插入大小）的大小对随后的数据分析产生影响，可以根据需要选择。对于基因组测序，通常选欧宝体育官网网址择几种不同的插入尺寸以在组装时获得更多信息。

•表面附件和桥梁放大

SOLEXA测序的反应在称为流动池的玻璃管中进欧宝体育官网网址行，并且流动池被细分为8个泳道，每个通道在每个车道的内表面上具有多个固定单链接头。将关节​​的DNA片段转化到单链中并与测序通道上的引物组合，以形成桥接性的结构，用于随后的前置放大。欧宝体育官网网址

•变性和完全放大

加入未标记的DNTP和普通TAQ酶用于固相桥PCR扩增，将单链桥样品扩增到双链桥片段中。通过变性，释放互补的单链并将其固定在附近的固体表面上。通过连续循环，将在流动池的固体表面上获得数百万簇的双链分析物。

•单个基本扩展和排序欧宝体育官网网址

将四种荧光标记的DNTPS，DNA聚合酶和接头引物加入到测序的流动细胞中进行扩增。当每个测序簇延伸互补欧宝体育官网网址链时，加入每个荧光标记的DNTP以释放相应的荧光。该测序器通过捕获荧光信号并通过计算机软件将光信号转换成测序峰值来获得要测试的片段的序列信息。欧宝体育官网网址读取长度受到导致信号衰减的多种因素的影响，例如不完全切割荧光标记。随着读数的长度增加，错误率也将增加。

• 数据分析

此步骤不是严格的排序过程的一部分，但它只能通过这一步骤前面的工作进行有意义。欧宝体育官网网址通过测序获得的原始数据是仅几十个碱基的序列，并且通欧宝体育官网网址过生物信息学工具组装这些短序列的轮廓甚至是整个基因组的框架。或者，这些序列与现有的基因组或类似种类的基因组序列对齐，并进一步分析以获得生物学上有意义的结果。

3.在全基因组测序中第三代测序测序的应用欧宝体育官网网址

虽然下一代测序使得具有小变体的人口级分析，但难以识欧宝体育官网网址别更大的结构变化。进一步，德诺维使用下一代测序的组装通常具有较低的质量与使用较旧的更昂贵的方法欧宝体育官网网址的质量较低。单分子测序技术可以克服这些困难，这可以跨欧宝体育官网网址越几乎整个染色体臂并且对GC含量不敏感。第三代排序技术已被用于生产高度准确欧宝体育官网网址的德诺维和用于微生物，植物，动物和人类的参考组件，使新的见解进化和序列多样性。

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