PacBio SMRT测序概述:原理、工作流程和欧宝体育官网网址应用欧宝官网app苹果下载

PacBio的SMRT(单分子实时)测序是最常用的第三代测序技术之一。欧宝体育官网网址与前两代人相比，PacBio读测序欧宝体育官网网址采用SMRT测序技术，无需PCR欧宝体育官网网址扩增，读取长度是NGS的100倍。

PacBio SMRT测欧宝体育官网网址序应用欧宝官网app苹果下载

PacBio SMRT测欧宝体育官网网址序可以用于基因组吗新创欧宝体育官网网址通过测序获得高质量的基因组序列，获取完整的转录组信息，检测可变剪接异构体，靶区不同的突变，以及表观遗传修饰等等。

PacBio SMRT测序原理欧宝体育官网网址

零模波导(Zero-mode waveguides, ZMWs)是在薄金属薄膜中制作的亚波长光学纳米结构，是一种强大的分析工具，能够将激发体积限制在阿陶勒斯范围内，它允许在荧光标记生物分子的生理相关浓度下分离单个分子进行光学分析。这种纳米结构的阵列也可以被设计成系统，用于实时分析大量的单分子反应或结合事件，这是PacBio SMRT测序的原理。欧宝体育官网网址

图2。单个SMRT Cell。每个SMRT Cell包含150w zmw。大约35000 - 75000口井在0.5-4小时内产生读数，产生0.5-1 Gb的序列。

PacBio SMRT测欧宝体育官网网址序利用ZMW的创新技术，将理想的荧光信号与由游离核苷酸引起的强荧光背景区分开来。DNA聚合酶和模板DNA链的结合被固定在ZMW的底部玻璃表面。由于ZMW的尺寸小于光的波长，激光通过ZMW的底部表面而不是完全穿透它。因此，它允许选择性激发和识别核苷酸发出的光招募碱基伸长。

图书馆建设

图书馆建设的工作流程包括以下几个步骤:

• 测定基因组DNA (gDNA)的质量
• 用g-TUBE (Covaris)剪切gDNA
• 选择大小和调整浓度
• 修复DNA损伤和DNA片段的末端
• 进行DNA纯化
• 钝端结扎使用钝适配器
• 净化模板以提交给测序器

这个被称为SMRTbell的模板是一个封闭的单链环状DNA，它是通过将发夹适配器连接到目标双链DNA (dsDNA)分子的两端而形成的。

图1所示。PacBio RS II系统的模板制备流程。

欧宝体育官网网址

如图3所示，SMRTbell(灰色)扩散到ZMW中，适配器与底部固定的聚合酶结合。四种核苷酸用不同的荧光染料标记(分别用红色、黄色、绿色和蓝色表示G、C、T和a)，因此它们有不同的发射光谱。当核苷酸被聚合酶保存在检测体积中时，就会产生识别碱基的光脉冲。(1)荧光标记的核苷酸与聚合酶活性位点的模板结合。(2)加入的碱基对应的颜色(此处以黄色表示碱基C为例)的荧光输出升高。(3)染料连接剂焦磷酸产物从核苷酸中裂解并扩散出ZMW，结束荧光脉冲。(4)聚合酶易位到下一个位置。(5)下一个核苷酸与聚合酶活性位点的模板结合，并启动下一个荧光脉冲，对应于这里的碱基A。

图3。欧宝体育官网网址通过光脉冲排序。

生物信息学分析

生物信息学分析，例如新创组装、参考基因组作图、基因组注释(致病和易感基因预测、非编码RNA预测、CRISPRs预测)、基因功能注释(COG/ GO/ KEGG)、SNP/InDel鉴定、比较基因组分析、进化分析和估计分化时间是可行的。

RS II和Sequel测序平台的比较欧宝体育官网网址

自2013年商用测序仪PacBio欧宝体育官网网址 RS II成功推出以来，第三代测序在基因组研究中得到了广泛应用。经过不断的改进和升级，PacBio于2015年10月推出了全新升级的第三代测序仪PacBio Sequel测序系统。欧宝体育官网网址下面是RS II和Sequel测序平台的比较。欧宝体育官网网址

Sequel平台比RS II平台有很大的优势，因为它可以在更短的时间内以更低的成本实现更高的通量测序。欧宝体育官网网址

PacBio SMRT测序特点欧宝体育官网网址

• 单分子的决议

PacBio SMRT测欧宝体育官网网址序不需要PCR扩增，容易覆盖高gc和高重复区域，对低频突变的定量更准确。

• 长时间阅读

PacBio SMRT测欧宝体育官网网址序提供非常长的读取。平均读取长度为8-15kb，最高可达40-70kb。

• 快速

PacBio SMRT测欧宝体育官网网址序效率高，每秒10 nt。

• 精度高

快速测序也带来了一些欧宝体育官网网址明显的缺点。例如，PacBio SMRT测序的错误率(这几乎是目前单分子测序技术的通病)可以达到10%-15%。欧宝体育官网网址但与下一代测序不同的是，这些错误是随机的，没有偏见。欧宝体育官网网址因此，通过多次测序可以有效地校正碱基偏差，PacBio SMRT测序的一致性精度可以大于99.999% (Q50)。欧宝体育官网网址

• 碱基改性的直接识别

碱基的改变可以在基因组测序时被直接检测到。
CD Genomics可以提供整合的PacBio SMRT测序服务，包括欧宝体育官网网址读宏基因组测序欧宝体育官网网址，细菌全基因组新创欧宝体育官网网址，真菌全基因组新创欧宝体育官网网址，全长转录本测序(Iso-Seq)欧宝体育官网网址，人类全基因组PacBio SMRT测序欧宝体育官网网址,全长16S/18S/ITS扩增子测序欧宝体育官网网址．如果您对我们的服务感兴趣，请随时与我们联系。

引用:

1. 香港,N。Ng, W,涛,K, Agulto, R, Weis。,和金,K . S。等．(2017)“用于细菌基因组测序的pacbio smrtbell ngs文库制备自动化”，欧宝体育官网网址基因组科学标准12(1) 27。
2. Rhoads, A.， & Au, K. F.(2015)“Pacbio测序及欧宝体育官网网址其应用”，欧宝官网app苹果下载基因组学，蛋白质组学与生物信息学13(5), 278 - 289。
3. PacBio的网站。