CRISPR / CAS9技术
CRISPR / CAS9技术是通过将Cas9内切核酸酶和引导RNA引入感兴趣的细胞来源的基因组编辑最受欢迎的方法之一。导向RNA设计用于将Cas9内切核酸酶引导至基因组中的特定部位，在那里它产生双链断裂（DSB）。通常有两种方法可以修复双链断裂：非同源终端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）。NHEJ是哺乳动物细胞修复的主要形式。由于它是易于出错的，通过NHEJ途径修复允许插入，删除，功能损失，这可能导致帧射击并影响蛋白质表达。除了淘汰突变突变之外，可以将模板DNA引入直接HDR并以令人生意的基因产生突变。HDR忠实地将模板序列复制到剪切目标站点。
图1.通过修复实现CRISPR / CAS9技术的基因组编辑。
基因组编辑验证
虽然CISPR系统对基因组编辑有效。但是，一些人口中的一些细胞将不会被编辑，有些细胞有一个等位基因编辑，有些则将两位等位基因编辑。在CRISPR / CAS9实验后验证基因组编辑非常重要。下一代测序欧宝体育官网网址（NGS）作为一种强大而高通量的方法，可用于筛选CRISPR诱导的突变。NGS可以同时查看大量样品中的偏移变化。使用此方法时，必须保留一组控制单元。CrisPresso等软件可用于数据分析。NGS也适用于评估由ZFN（锌 - 手指核酸酶）或TALEN（转录活化剂样效应核酸酶）产生的基因组编辑。
Sentmanat.等。（2018）描述了他在发布工作中的基因组验证的NGS方法。简要地，CRISPR测欧宝体育官网网址序涉及两步PCR方案和深度测序。欧宝体育官网网址首先，利用含有部分illumina测序适配器的引物扩增靶基因组遗址。欧宝体育官网网址接下来，第二个PCR具有含有索引和必要的illumina测序适配器的引物。欧宝体育官网网址结果，目标区域将被扩增。然后用Illumina MiSeq平台对合格的PCR产物进行深度测序。欧宝体育官网网址
检测离目标突变
另一个CRISPR技术的限制是脱离目标削减的发生。CRISPR系统不仅削减其目标位置，而且在有意义的网站上削减了具有相似序列的意外网站。这些脱靶切割可能产生不希望的甚至有害的突变。在过去几年中，科学家已经建立了几种基于NGS的方法来检测脱靶突变。
表1.基于NGS的检测偏离目标突变的方法。
| 测定 | 描述 | 资源 |
| 体外基因组测定 | ||
| Digenome-SEQ. | 首先用核酸酶消化基因组DNA，然后进行全基因组测序欧宝体育官网网址。可以计算偏离目标。 | 金等。2015年 Web工具：http：//www.rgenome.net/digenome-js/#！ 代码：https://github.com/chizksh/digenome-toolkit2. |
| Circle-SEQ. | 基因组DNA被剪切和圆形化。残留的线性DNA降解。然后，CAS9用于线性化含有Cas9切割位点的圆形DNA。裂解的末端被PCR扩增和由NGS技术进行测序，以识别偏离目标。 | 蔡等。2017年 代码：https://github.com/tsailabsj/circleseq. |
| 网站SEQ. | 使用Cas9核酸酶切割基因组DNA，并且Cas9核酸酶切割位点是生物化学标记和富含的。然后使用高通量测序和生物信息学分欧宝体育官网网址析来检测脱靶切割位点。 | 卡梅伦等。2017年 协议：协议交换，DOI：10.1038 / Protex.2017.043 |
| 基于细胞的基因组范围 | ||
| 指南SEQ. | 使用CAS9创建的DSB使用小的双链寡核苷酸，PCR扩增，并使用Ngs分析。 | 蔡等。2015年 代码：https：//github.com/aryeelab/guideSeq. |
| LAM-HTGTS. | 脱靶和靶突破的染色体易位是PCR扩增并通过NGS分析。 | 卷等。2015年 协议：NAT PROTOC，11：853-71,2016 代码：http：//robinmeyers.github.io/transloc_pipeline/index.html |
| bl | DSB是生物化学标记的，并且它们的下游序列是PCR扩增并使用NGS分析。 | y等。2017年 |
参考：
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