还原亚硫酸氢盐测序(RRBS)简介欧宝体育官网网址

DNA甲基化是什么？

DNA甲基化是在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下，在DNA链上添加一个甲基(CH3)。DNA含有四种含氮碱基，分别是胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和腺嘌呤(图1A)。研究人员发现胞嘧啶和腺嘌呤可以被甲基化。胞嘧啶甲基化通常发生在胞嘧啶的5-碳位(5-methylcytosine or 5mC)，这种甲基化只存在于整个基因组DNA双螺旋上对称的CG位点，即CpG岛(图2B)。胞嘧啶甲基化在真核生物和原核生物中广泛存在(Cloney, 2016;库珀,1983)。腺嘌呤甲基化发生在腺嘌呤的6-氮位置(N6-methyladenine或N6mA)。腺嘌呤甲基化已经在细菌、植物和哺乳动物的DNA中观察到(Ratel等, 2006;吴等.， 2016)，但却很少受到关注(图2B)。

图1.（a）DNA和RNA中发现的含氮基础。（b）胞嘧啶和腺嘌呤的甲基化。

DNA甲基化是与基因抑制相关的最重要的表观遗传修饰之一(图2)，已知在胚胎发育、多能性的维持、基因组印记和通过转录调控的x染色体失活中发挥重要作用。染色质结构和染色体稳定性(Robertson, 2005)。DNA甲基化也会影响健康，导致癌症、自身免疫性疾病、神经系统疾病或其他疾病。在许多疾病过程中，基因启动子CpG岛获得异常的高甲基化，导致转录沉默，可由细胞分裂后的子细胞继承(Wang和Lei, 2018)。DNA甲基化模式的改变已经被认为是癌症发展的重要组成部分(图3)。

图2。基因表达可以在转录开始前通过DNA或相关组蛋白的化学修饰(DNA甲基化和组蛋白乙酰化)来调控(Mukherjee)等, 2015)。

图3. DNA甲基化和癌症。TSG：肿瘤抑制基因。（罗伯逊，2005）

DNA甲基化检测和RRB

要了解DNA甲基化在发育和疾病中的作用，需要了解这些修饰在基因组中的分布(哈里斯)等, 2010)。测量5mC或5hmC(5-羟甲基胞嘧啶)的总量可以让研究人员深入了解深刻的生物学过程，并识别疾病的生物标志物。DNA甲基化模式的检测是一个快速发展的研究领域，已有几种方法用于评估DNA甲基化，亚硫酸氢盐处理是大多数人的中心程序。图4展示了一种选择合适的DNA甲基化分析方法的简单算法(Kurdyukov和Bullock, 2016)。

图4.用于选择合适的DNA甲基化分析方法的算法。改编自（Kurdyukov和Bullock，2016）

亚硫酸氢盐测序是使用欧宝体育官网网址亚硫酸氢盐处理DNA，以确定其甲基化模式(Frommer等, 1992)。DNA的亚硫酸氢盐处理介导胞嘧啶脱氨为尿嘧啶，通过pcr扩增和随后的测序分析，这些转化后的残基将被解读为胸腺嘧啶(图5)。欧宝体育官网网址

图5.通过亚硫酸氢盐测序测量DNA甲基化（由Illumina成像）。欧宝体育官网网址

全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）欧宝体育官网网址是DNA甲基化分析最全面的方法，现在已被认为是DNA甲基化研究中的“黄金标准”方法。唯一的限制是NGS数据分析中的成本和困难。降低表示亚硫酸氢盐测序（RRB）欧宝体育官网网址将限制酶和亚硫酸氢盐测序结合以富集具有高CpG含量的基因组区域的富集，是用于分析单个核苷酸水平的基因组欧宝体育官网网址甲基化谱的有效和高通量技术。该方法可以减少序列所需的核苷酸的数量，以1％的基因组（Meissner等, 2005)。由于它的经济和生产方式，RRB.已经被用于快速分析癌症中的异常甲基化(Smith等2009年）和甲基化国家在发展中。

工作流的rrb

RRB的协议如图6所示。该过程包括几个步骤：

• 酶消化
  使用甲基化 - 不敏感的限制酶消化基因组DNA的各种尺寸的DNA片段。MSPI通常使用。
• 图书馆准备
  在酶消化后，图书馆制剂，进行了由端部修复，尾翼和测序适配器连接的过程。欧宝体育官网网址MSPI消化的反应导致粘性末端的股线。最终修复是必要的，以填充股线末端的3'端子。在随后的步骤中，为甲基化序列衔接子结扎需要将额外的腺苷添加额外的腺苷。
• 尺寸选择
  然后，对生成的片段进行大小选择。用凝胶电泳分离不同大小的片段，用凝胶切取纯化。
• 亚硫酸氢转换
  尺寸选择后，进行亚硫酸氢盐转换，其中未甲基胞嘧啶脱胺成尿嘧啶。
• PCR扩增和纯化
  亚硫酸氢盐转换的DNA然后使用PCR扩增与序列适配器互补的引物。测序前需要进行PCR纯化。欧宝体育官网网址
• 欧宝体育官网网址
  然后使用欧宝体育官网网址下一代测序技术进行测序。最常见的是Illumina平台。

图6。亚硫酸氢盐排序协议。欧宝体育官网网址(谷歌)

RRBS的优点和局限性

与WGBS和其他DNA甲基化检测方法相比，RRBS具有一定的技术优势。但是在具体的协议步骤中也有一些限制。

• 好处：
• RRBS利用特异性限制性内切酶，可以丰富基因组的CpG区域，减少测序量，降低成本。欧宝体育官网网址
• 准确的数据分析只需要较低的样品浓度。
• 限制
• 酶切不能覆盖基因组中所有的CG区域。部分CpG缺失，部分区域覆盖较低。
• 可以发生PCR扩增误差。
• 完全二硫酸氢盐转化双链DNA（DSDNA）需要变性步骤，因为亚硫酸氢盐测序仅转化单链DNA（SSDNA）。欧宝体育官网网址

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引用:

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